本文目录
- western blot的操作程序
- 做好westernblot需要注意各种细节，转给需要的你！
- wb实验的原理和步骤
- 免疫组化和western blot的区别
- western-blot实验步骤
- westernblot的原理及操作步骤，应用有哪些
- western blotting的原理、操作步骤及意义
- western blot的具体步骤
- Western-blot实验ECL发光检测实验步骤
western blot的操作程序
这是我用过的，论文中的步骤：取离心处理好的样品裂解液，进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，浓缩胶中以80V恒压电泳，待样品进入分离胶后改为160V恒压电泳。当溴酚蓝前沿迁移至分离胶下层边缘时停止电泳，采用硝酸纤维膜转膜。将胶、硝酸纤维膜及滤纸放于电转缓冲液中平衡10分钟,电转夹从负极到正极组装顺序依次为：滤纸→胶→硝酸纤维膜→滤纸，用玻璃棒排出气泡。以130mA恒流、冰浴条件下转膜3小时。转膜完毕后，用5%封闭液（含5%脱脂奶粉的TBST）封闭1小时，用TBST洗涤三次，每次洗涤5分钟。用加入含一抗的封闭液室温孵育2小时，TBST洗涤三次，每次洗涤5分钟。加辣根过氧化物酶偶联的二抗（1:10 000稀释），室温作用1小时，TBST洗涤三次，每次洗涤5分钟。用ECL显色液显色。
做好westernblot需要注意各种细节，转给需要的你！
做好Western需要注意各种细节。工欲善其事，必先利其器，首先还是从蛋白提取开始谈起。
1.收样前3min先配制细胞裂解液（现配现用），RIPA:蛋白酶抑制剂:磷酸酶抑制剂=99:1:1。6孔板收集蛋白每孔需200ul，计算用量。以收集六孔蛋白为例，按比例加入RIPA 1200ul，蛋白酶抑制剂12ul，磷酸酶抑制剂12ul，混匀后置于冰上。（我使用的试剂RIPA裂解液（中），蛋白酶抑制剂混合物（100×），蛋白磷酸酶抑制剂混合物（100×）均购自***公司） 2.弃掉旧的培养基，PBS洗三遍。 3.每孔加入200ul刚配好的裂解液，立即置于冰上，在摇床上裂解30min。
（全程在冰上操作） 1.将动物组织（脑、肺等）取出后分装成三份或更多（一份WB，一份qPCR，一份备用），取出后立即存于-80℃。（注：取完一块组织后立即冻存于-80℃，反复冻存样品对待测蛋白有影响，最好用新鲜样品实验） 2.配制细胞裂解液（现配现用），组织:RIPA=1mg:10ul，可根据实际情况调整。RIPA:蛋白酶抑制剂:磷酸酶抑制剂=99:1:1。配好后置于冰上。 3.将其中一份组织剪下约90mg于有钢珠的震荡匀浆器中匀浆。此匀浆器的盖子或芯通常置于-20℃，使用时取出，操作应快捷，匀浆1min基本可保持温度。 4.将匀浆加入90ul现配的裂解液中，冰上摇床裂解30min。
我采用的是***公司的BCA蛋白定量试剂盒测定提取蛋白浓度，和说明书protocol差别不大，稍有不同，如下： 1.稀释BSA标准品以制作标准曲线：取7支EP管，每管加30ul生理盐水，第一管加30ulBSA，混匀后再取30ul至第二管，依次倍比稀释，最后一管不加为空白（即本底值）。则8个标准品的浓度分别为2ug/ul、1ug/ul、0.5ug/ul、0.25ug/ul、0.125ug/ul、0.0625ug/ul、0.03125ug/ul、0。
可提前配制：
戴好口罩和手套，选用1.0mm玻板，用试管刷和洗洁精仔细刷洗玻板，清水冲洗干净。卡槽对齐卡好后置于软橡胶垫片上，夹紧，向板中加满蒸馏水试板子是否漏液。观察几分钟后若不漏液，将板子中水倒出，倒扣晾干。
1.配制8ml 10%分离胶，依次向小烧杯中加入蒸馏水3.04ml，30%丙烯酰胺2.7ml，1.5M•pH8.8 2.0ml，10%SDS 80ul，10%AP 80ul，TEMED 3.2ul。加入TEMED混匀后立即灌胶，用1ml枪头沿着玻板上沿从左至右轻轻将胶打入，以免胶浓度不均匀，避免气泡产生。加完后换200ml枪头从左至右更加小心加入蒸馏水水封，以免冲散刚灌的分离胶。静置，当水和胶之间出现一条水平的折线时，即已凝固。 2.待分离胶凝固后，将水封的蒸馏水倒出，可将滤纸条放于玻板角吸水加快残留水流出，倒置。配制4ml 5%分离胶，依次向小烧杯中加入蒸馏水2.7ml，30%丙烯酰胺670ml，0.5M•pH8.8 500ul，10%SDS 40ul，10%AP 40ul，TEMED 4ul。加入TEMED混匀后立即灌胶，同上用1ml枪头从左至右轻轻加入浓缩胶，加满后冲洗10孔梳子，水平轻轻插入浓缩胶中静置待其凝固。可将剩余的浓缩胶沿着梳子加入玻板中以完全密封。 3.此时，可将之前分装好的煮过的加入loading buffer的蛋白样品、预染的蛋白maker 和一小支loading buffer 置于4℃融化。 Little Trick 1.AP和TEMED均为神经毒性、致癌物质，使用时需小心。 2.灌胶时视线与胶面水平，注意操作，避免胶溅入眼睛中。 3.常温下半小时胶可凝固，若天气寒冷或需加快凝固，可将其置于37℃孵箱中，15min左右即可凝固。 4.若第二天早上立即跑胶，这样就不耽误午饭时间，可头天晚上先把胶配好，凝固后取下玻板，连夹子、梳子一同放入蒸馏水中，4℃过夜保存。
1.将玻板卡紧电泳槽中，先在内槽加满已配好的1×电转液，十几分钟后观察是否漏液，若漏液重新调整玻板，再次卡紧，直至不漏液为止。否则，可能胶还没跑完，电转液就漏完了。 2.轻轻拔去梳子，第一孔加入5ul预染的蛋白maker ，2~7孔依次加入20ul待测蛋白样品，第8孔加入10ul提前融化的loading buffer。上样时轻轻加入，注意不要将样品加入其他孔，或加样过快导致样品溢出。 3.插好正负极，注意检查正负极不能插反。调节电压至80V（浓缩胶），跑0.5h后；将电压调至100V（分离胶），约1.5h后，maker分离明显，在胶底部出现一条蓝色的buffer条带，此时电泳完毕。使用完在实验仪器使用本上做好登记。 注意：避免蓝色条带跑出分离胶，这样有可能目的蛋白也已经跑出，所以在分离胶底部出现一条整齐水平的蓝色条带时，即停止电泳。 Little Trick 1.电泳时插好正负极后，从电泳槽底会有小气泡上升，气泡的数目和上升速率与电压大小呈正比。若小气泡和往常不太一样，观察几分钟后还是如此，则需检查是否加错了电泳液，或者电泳液配制有误。 2.一般浓缩胶80V 0.5h，分离胶100~120V 1~1.5h，具体跑胶电压和时间与目的蛋白大小、实验仪器和实验室环境都有关，需多次探索最佳条件。若目的蛋白较小，则尽量缩短跑胶时间，并及时观察maker位置，避免目的蛋白跑出。我分别实验了浓缩胶80V 0.5h，80V 1h，分离胶120V 1.5h，120V 1h，100V 1.5h，100V 1h，110V 1.5h，110V 1h，结果显示在本实验室实验仪器下，我的目的蛋白及内参在浓缩胶80V 0.5h，分离胶100V 1.5h条件下，分离效果最好。在此条件下，我做了几次重复实验，结果均一致。因此，总结出本实验室此目的蛋白的最佳电泳条件。 3.电泳的好坏直接影响到目的蛋白的显影情况，尤其时磷酸化目的蛋白的二聚体，若电泳条件优化，结果可清晰显出蛋白表达情况。所以探索最佳电泳条件是决定胜负关键一步。 4.电泳快结束时即可准备转膜所需的滤纸和PVDF膜，浸泡在电转液中。建议在第一次WB后分别剪好不同大小的硬纸片，标好面积和孔数（即样品数），存好以后随时使用。 5.WB中夹取PVDF膜最好使用平头镊子，并夹住膜左上角，可最大程度减小对膜上蛋白的损害。
电泳结束后，取出玻璃板，稍微冲洗，洗净电泳槽，放好。轻轻撬开玻璃板，根据maker位置和目的蛋白分子量大小在玻璃板上切胶，为了防止切歪，可在玻璃板下垫上上述剪好的同切胶大小一致的硬纸片。一般一块胶需切下目的蛋白和内参两小块胶，将切下的胶分别浸泡在电转液中。
1.根据每一块切胶的大小剪6张同样大小的滤纸和一张PVDF膜，浸泡于电转液中，可以提前准备好的硬纸片为模板剪。PVDF膜先经甲醇活化20s后浸泡于电转液中。 2.在电转仪上制作“三明治”结构转移膜，最下面放三层滤纸，然后依次放PVDF膜，胶，三层滤纸，用玻璃棒轻轻赶走气泡（注意上下三层滤纸之间不能接触，否则易造成短路）。盖上盖子，根据膜的总面积调整电流，电转2h。 3.在电转的同时，可以配制以下液体，事先根据膜的数量计算好所需体积： 以一块膜为例，封闭5ml+稀释一抗4ml+稀释二抗4ml，需要13ml，则配制15ml。 5% BSA溶液(w/v)：配制15ml 5% BSA溶液(w/v)，称取0.75g BSA晶体，溶于15mlTBST中，漩涡振荡器混匀，现用现配，4℃保存（若目的蛋白为磷酸化蛋白时配制）。 5%牛奶(w/v)：配制15ml 5%牛奶(w/v)，称取0.75g脱脂奶粉，溶于15ml TBST中，漩涡振荡器混匀，现用现配，4℃保存。 1×TBST洗液：使用时将100×TBST用双蒸水稀释至1×，常温保存。 Little Trick 1.关于电转膜，有些使用NC膜。我没有尝试过NC膜，但隔壁实验室使用NC膜多次WB结果仍不理想，换用PVDF膜后有所改善。因此建议还是使用PVDF膜，可购买Millipore的PVDF膜，一卷有些贵，但是可以够一个实验室用好几年哪。最好不要在经销商购买分装的的PVDF膜，另一实验室一同学想着价格便宜也就只做几次，就从试剂公司只买了100cm2的膜，结果这价格虚高不说，而且膜还是假的，直到做完实验了才发现，蛋白样品也浪费了。所以建议还是购买Millipore公司原装的PVDF膜。 2.关于电转方式，有些采用湿转，有些采用半干转，两种方式均可。个人觉得半干转方便简捷些。
1.电转结束后，根据maker位置和目的蛋白及内参大小剪膜。可在标有maker的一边左上角剪一个小角，以清楚哪一条带是1号样品。 2.分别用已配好的5% BSA和5%牛奶封闭目的蛋白和内参，室温摇床上孵育2h。根据盒子大小，加入封闭液的量需没过膜。
1.配制p-STAT1一抗（ 公司），1:500稀释，加入上述配制的5% BSA 4ml，再加入8ul p-STAT1一抗，混匀，现配现用。 配制actin一抗（ 公司），1:2000稀释，加入上述配制的5%牛奶4ml，再加入2ul actin一抗，混匀，现配现用。 2.将PVDF膜从封闭液中取出，可用平头镊子小心放入塑料手套的手指中，加入一抗，封口，使膜完全浸泡在一抗中，放入冰箱，4℃过夜。我一般用封口膜做成小盒，置于大玻璃平皿中，放入PVDF膜，用枪从上到下向膜上加一抗，完全浸没，之后和PCR上样仪一同固定在摇床上，4℃孵育过夜。
次日，回收一抗，做好标记，-20℃保存，可再使用3~4次。将膜放入1×TBST中，摇床上清洗三次，每次10min。
1.配制具有种属特异性的HRP标记的二抗（抗鼠或抗兔），1:2000稀释，加入上述配制的5%牛奶4ml，再加入2ul 二抗，混匀，现配现用。 2.TBST洗完膜后，加入二抗，室温摇床上孵育2h。
1.二抗孵育完后，回收，-20℃保存。1×TBST摇床上洗膜三次，每次10min。 2.一条目的蛋白即一张膜需要100ul发光液A和100ul发光液B，根据膜数计算用量，提前4℃混合好发光液A和B。 3.到暗室中加混合好的发光液，在胶片左上角剪一小角（和PVDF膜一致），曝光胶片，可分别不同时长曝光，如15s，30s，1min，5min等，然后在显影液和定影液中显影，放入自来水中。出暗室后，将胶片挂起晾干。 也可用Bio-rad凝胶成像系统照相，选择不同的曝光时间成像。 Little Trick1.需通过不同曝光时间探索某蛋白最佳曝光时间，多次重复实验即可采用此曝光时长。我最开始也是在暗室中显影，后来用Bio-rad凝胶成像系统照相，对比结果发现后者的结果更加清晰明显，背景也更加干净，之后就一直用成像仪曝光照相了。 2.夹取胶片可用普通镊子，但也只夹胶片左上角，避免损害胶片上曝光的蛋白条带。 3.胶片左上角maker一侧一定要剪一小角或做其它标记，才可在显影后明显对应各个样品。 4.若暗室曝光，可能内参蛋白发光液刚加上就出现很亮的条带，这时最长曝光15s已经足够。
若显影效果不好，可将膜重生，再次显影，省去了配胶、电泳和电转等步骤。 1.加4ml蛋白印迹膜再生液，室温摇床30min。
wb实验的原理和步骤
WB实验是通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）将混合蛋白质样品分离后，利用特殊虹吸或电场装置印迹至固相介质（例如PVDF膜）上。
再以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与相对应的第一抗体特异性结合，之后再与酶或同位素标记的第二抗体相结合，最终通过底物显色或放射自显影来检测特异性目的基因表达的蛋白成分。
扩展资料：
WB，蛋白质印迹（Western blotting）又称免疫印迹（immunoblotting）,是采用印迹技术将蛋白质转移到膜上，再根据抗原-抗体的特异性结合，检测复杂样品中的某种蛋白的方法，该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。
一、蛋白样本提取制备
1 细胞或组织裂解2 蛋白酶和磷酸酶抑制剂3 蛋白定量4 电泳上样样品的准备
二、 电泳
1 PAGE 胶的制备2 蛋白分子量 Marker3 阳性对照4 内参对照5 上样与电泳
三、 转膜与显色（ Western Blot）
1 胶中蛋白的检测2 蛋白转膜3 膜上蛋白的检测：丽春红4 膜的封闭5 一抗的孵育6 二抗的孵育7 显色
四、常见问题分析与解决方案五、试剂及缓冲液配方
一、蛋白样本提取制备
蛋白样品制备是 Western Blotting 的第一步，是决定 WB 成败的关键步骤之一。
蛋白提取总体原则与注意事项包括：
1) 尽可能提取完全或降低样本复杂度使得集中于提取目的蛋白（通过采用不同提取方法或选择不同的试剂盒产品）。
2) 保证蛋白处于可以溶解状态（通过裂解液的pH 、盐浓度、 表面活性剂、还原剂等的选择实现）。
3) 提取过程防止蛋白降解、聚集、沉淀、修饰等（全程保证在冰盒中低温操作，加入合适的蛋白酶和磷酸酶抑制剂）。
4) 尽量去除核酸，多糖，脂类等干扰分子（通过加入核酸酶或采取不同提取策略）。
5) 样品分装，长期于-80℃中保存，避免反复冻融。
免疫组化和western blot的区别
1、原理不同：
免疫组化利用抗体和抗原之间的结合具有高度的特异性。先将组织或细胞中的某种化学物质提取出来，以此作为抗原或半抗原，通过免疫动物后获得特异性的抗体，再以此抗体去探测组织或细胞中的同类的抗原物质。
western blot也是利用抗体和抗原之间的结合具有高度的特异性。经过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的蛋白质样品，转移到固相载体上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应。
2、组织定位不同：
免疫组化在组织定位和定性上比较准确，但是在定量上不够准确。western blot因为有内参标定，所以在定量上要更加准确，但是在组织定位上不如免疫组化。
扩展资料：
一、 免疫组化（SP法）操作步骤：
1、切片常规脱蜡至水。如需抗原修复，可在此步后进行。
2、缓冲液洗 3min／2 次。
3、为了降低内源性过氧化物酶造成的非特异性背景染色，将切片放在 Hydrogen Peroxide Block 中孵育 10－15 分钟。
4、缓冲液洗 5min／2 次。
5、滴加 Ultra V Block ， 在室温下孵育 5 分钟以封闭非特异性的背景染色。
6、缓冲液洗 5min／2 次。
7、滴加一抗工作液 37 ℃孵育 1 － 2 小时。
8、缓冲液洗 5min／2 次。
9、 滴加 Primary Antibody Enhancer（增强子），在室温下孵育 20 分钟。
10、缓冲液洗 5min／2 次。
11、滴加 HRP Polymer（酶标二抗） ，在室温下孵育 30 分钟。
12、缓冲液洗 5min／2 次。
13、向 1ml DAB Plus Substrate （或 AEC Plus Substrate） 中滴加 1－2 滴 DAB Plus Chromogen （或 AEC Plus Chromogen），混匀后滴加到切片上，孵育 3 － 15 分钟。
14、自来水充分冲洗，复染，脱水，透明，封片。
二、 western blot操作步骤：
1、SDS－PAGE试剂：见电泳实验。
2、匀浆缓冲液：1．0M Tris－HCl（pH 6．8）1．0ml；10％SDS 6．0ml；β－巯基乙醇 0．2ml；ddH2O 2．8ml。
3、转膜缓冲液：甘氨酸 2．9g；Tris 5．8g；SDS 0．37g；甲醇200ml；加ddH2O定容至1000ml。
4、0．01M PBS（pH7．4）：NaCl 8．0g；KCl 0．2g；Na2HPO4 1．44g；KH2PO4 0．24g；加ddH2O至1000ml。
5、膜染色液：考马斯亮兰 0．2g；甲醇80ml；乙酸2ml；ddH2O118 ml。包被液（5％脱脂奶粉，现配）：脱脂奶粉1．0g 溶于20ml的0．01M PBS中。
6、显色液：DAB 6．0mg；0．01M PBS 10．0ml；硫酸镍胺 0．1ml；H202 1．0μl。
western-blot实验步骤
Western，也称Western blot、Western blotting、Western印迹，是用抗体检测蛋白的重要方法之一。可按照以下步骤操作。 1.收集蛋白样品(Protein sample preparation) 使用细胞裂解液，对贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品进行裂解。然后测定每个蛋白样品的蛋白浓度。 2. 电泳(Electrophoresis) (1) SDS-PAGE凝胶配制 SDS-PAGE凝胶（分离胶及浓缩胶）可以参考一些文献资料进行配制 (2) 样品处理 在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。使用5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以减小上样体积，在相同体积的上样孔内可以上样更多的蛋白样品。5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以参考相关文献资料配制， 100℃或沸水浴加热3-5分钟，以充分变性蛋白。 (3) 上样与电泳 （1）冷却到室温后，把蛋白样品直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内即可。 为了便于观察电泳效果和转膜效果，以及判断蛋白分子量大小，最好使用预染蛋白质分子量标准。 （2）电泳时通常推荐在上层胶时使用低电压恒压电泳，而在溴酚蓝进入下层胶时使用高电压恒压电泳。对于Bio-Rad的标准电泳装置 或类似电泳装置，低电压可以设置在80-100V，高电压可以设置在120V左右。 （3）为了电泳方便起见，也可以采用整个SDS-PAGE过程恒压的方式，通常把电压设置在 100V，然后设定定时时间为90－120分钟。设置定时可以避免经常发生的电泳过头。通常电泳时溴酚蓝到达胶的底端处附近即可停止电泳，或者可以根据预染蛋白质分子量标准的电泳情况，预计目的蛋白已经被适 当分离后即可停止电泳。 3. 转膜(Transfer) （1）我们推荐在Western实验中选用PVDF膜。硝酸纤维素膜(NC膜)也可以使用，但硝酸纤维素膜比较脆，在操作过程中特别是用镊子夹取等过程中容易裂开。膜的使用请参考生产商的推荐使用步骤。通常如果使用Bio-Rad的标准湿式转膜装置，可以设定转膜电流为300-400mA，转膜时间为30-60分钟。也可以在15-20mA转膜过夜。具体的转膜时间要根据目的蛋白的大小而定，目的蛋白的分子量越大， 需要的转膜时间越长，目的蛋白的分子量越小，需要的转膜时间越短。 （2）在转膜过程中，特别是高电流快速转膜时，通常会有非常严重的发热现象，最好把转膜槽放置在冰浴中进行转膜。 转膜的效果可以观察所使用的预染蛋白质分子量标准，通常分子量最大的1-2条带较难全部转到膜上。转膜的效果也可以用丽春 红染色液对膜进行染色，以观察实际的转膜效果。也可以用考马斯亮蓝快速染色液对完成转膜的SDS-PAGE胶进行染色，以观察蛋白的残留情况。 4. 封闭(Blocking) （1）转膜完毕后，立即把蛋白膜放置到预先准备好的Western洗涤液中，漂洗1-2分钟，以洗去膜上的转膜液。从转膜完毕后所有的步骤，一定要注意膜的保湿，避免膜的干燥，否则极易产生较高的背景。 （2）用微型台式真空泵吸尽洗涤液，加入Western封闭液，在摇床上缓慢摇动,室温封闭60分钟。对于一些背景较高的抗体，可以在 4℃ 封闭过夜。 5. 一抗孵育(Primary antibody incubation) （1）参考一抗的说明书，按照适当比例用Western一抗稀释液稀释一抗。 （2）用微型台式真空泵吸尽封闭液，立即加入稀释好的一抗，室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。如果一抗孵育一小时效果 不佳，可以在4℃缓慢摇动孵育过夜。 （3）回收一抗。加入Western洗涤液，在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤5-10分钟。吸尽洗涤液后，再加入洗涤液，洗涤5-10分钟。共洗涤3次。如果结果背景较高可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。 6. 二抗孵育(Secondary antibody inucubation) （1） 参考二抗的说明书，按照适当比例用Western二抗稀释液稀释辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗。 （2）用微型台式真空泵吸尽洗涤液，立即加入稀释好的二抗，室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。 （3）回收二抗。加入Western洗涤液，在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤5-10分钟。吸尽洗涤液后，再加入洗涤液，洗涤5-10分钟。共洗涤 3次。如果结果背景较高可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。 7. 蛋白检测(Detection of proteins) （1） 参考相关说明书，可使用英格恩的Enlight等超敏ECL发光液来检测蛋白。 （2）洗片时可以使用X光片自动洗片机。如果没有自动洗片机，可以用显影定影试剂盒自行配制显影液和定影液进行手工洗片。 8. 膜的重复利用(Membrane recovery) 如果蛋白样品非常宝贵，可以使用Western一抗二抗去除液处理蛋白膜，以重复利用蛋白膜
westernblot的原理及操作步骤，应用有哪些
原理Western Blot与Southern印迹杂交或Northern印迹杂交方法类似,但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳,被检测物是蛋白质,“探针”是抗体,“显色”用标记的二抗.经过PAGE分离的蛋白质样品,转移到固相载体（例如硝酸纤维素膜NC膜）上,固相载体以非共价键形式吸附蛋白质,且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变.以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原,与对应的抗体起免疫反应,再与酶或同位素标记的第二抗体起反应,经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分.该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达.分类Western Blot显色的方法主要有以下几种：i.放射自显影 ii.底物化学发光ECL iii.底物荧光ECF iv.底物DAB呈色 现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色,体同水平和实验条件的是用第一种方法,目前发表文章通常是用底物化学发光ECL.只要买现成的试剂盒就行,操作也比较简单,原理如下（二抗用HRP标记）：反应底物为过氧化物+鲁米诺,如遇到HRP,即发光,可使胶片曝光,就可洗出条带.其他值得一提的是,western blot 这个名称的由来很有意思.最开始做印迹工作的是一个叫做Southern的科学家,但印迹的对象是DNA链,他把这种技术称为Southern blot,后来类似的出现了两个过程相似,但是对象不同的印迹方法,一个针对RNA,一个对蛋白质,人们分别把这两种技术的称为Northern和Western,与这两个技术的发明人没有关系了.
western blotting的原理、操作步骤及意义
一。免疫印迹法
免疫印迹法（immunoblotting test，IBT）亦称酶联免疫电转移印斑法（enzyme linked immunoelectrotransfer blot，EITB），因与Southen早先建立的检测核酸的印迹方法Southen blot相类似，亦被称为Western blot。免疫印迹（western blotting）是在蛋白质电泳分离和抗原抗体检测的基础上发展起来一项检测蛋白质的技术。它将SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳的高分辨力与抗原抗体反应的特异性相结合。典型的印迹实验包括三个步骤①蛋白质的电泳分离；②将电泳后凝胶上的蛋白质转移至固体膜上，用非特异性，非反应活性分子封闭固体膜上未吸附蛋白质区域；③免疫学检测。免疫印迹克服了聚丙烯酰胺凝胶电泳后直接在凝胶上进行免疫学分析的弊端，极大地提高了其利用率、分辨率和灵敏度，使其成为使用最广泛的免疫化学方法之一。
第一阶段为SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）。抗原等蛋白样品经SDS处理后带阴电荷，在聚丙烯酰膪凝胶中从阴极向阳极泳动，分子量越小，泳动速度就越快。此阶段分
离效果肉眼不可见（只有在染色后才显出电泳区带）。第二阶段为电转移。将在凝胶中已
经分离的条带转移至硝酸纤维素膜上，选用低电压（100V）和大电流（1～2A），通电45min
转移即可完成。此阶段分离的蛋白质条带肉眼仍不可见。第三阶段为酶免疫定位。将印
有蛋白质条带的硝酸纤维素膜（相当于包被了抗原的固相载体）依次与特异性抗体和酶
标第二抗体作用后，加入能形成不溶性显色物的酶反应底物，使区带染色。常用的HRP
底物为3，3，—二氨基联苯胺（呈棕色）和4-氯-1-萘酚（呈蓝紫色）。阳性反应的条带清晰
可辨，并可根据SDS-PAGE时加人的分子量标准，确定各组分的分子量。本法综合了
SDS-PAGE的高分辨力和ELISA法的高特异性和敏感性，是一个有效的分析手段，不仅
广泛应用于分析抗原组分及其免疫活性，并可用于疾病的诊断。在艾滋病病毒感染中此
法作为确诊试验。抗原经电泳转移在硝酸纤维素膜上后，将膜切成小条，配合酶标抗体
及显色底物制成的试剂盒可方便地在实验室中供检测用。根据出现显色线条的位置可判
断有无针对病毒的特异性抗体。
Westernblot 实验步骤及注意事项
一.实验步骤
1. 组织块称重
2. 利用液氮、研钵粉碎组织块
3. 加入RIPA缓冲液（每克组织3 ml RIPA），PMSF（每克组织30μl，10 mg/ml PMSF），利用Polytron进一步匀浆（15,000转/分*1分钟）维持4℃
4. 加入PMSF（每克组织30μl，10 mg/ml PMSF），冰上孵育30分钟
5. 移入离心管4℃ 约20,000 g（约15,000转）15分钟
6. 上清液为细胞裂解液可分装-20℃保存
7. 进行Bradford比色法测定蛋白质浓度
8. 取相同质量的细胞裂解液（体积*蛋白质浓度），并加等体积的2×电泳加样缓冲液
9. 沸水浴中3分钟
10. 上样
11. 电泳（浓缩胶20mA，分离胶35mA）
12. 电转膜仪转膜（100mA 40分钟）
13. 膜用丽春红染色，胶用考马斯亮蓝染色
14. Westernblot 试剂盒显色
15. 分析比较记录
western blot的实验步骤及注意事项的资料
1. 把聚丙烯酰胺凝胶中的蛋白质电泳转移到硝酸纤维膜上。
1）转移缓冲液洗涤凝胶和硝酸纤维素膜，将硝酸纤维素膜铺在凝胶上，用5ml移液管在凝胶上来回滚动去除所有的气泡。
2）在凝胶/滤膜外再包一张3mm滤纸（预先用转移缓冲液浸湿），将凝胶夹在中间，保持湿润和没有气泡。
3）将此滤纸/凝胶/薄膜滤纸按照厂家建议方法放入电泳装置中，凝胶面向阴极。
4）将上述装置放入缓冲液槽中，并灌满转移缓冲液以淹没凝胶。
5）按照厂家所示接通电源开始电泳转移。
6）转移结束后，取出薄膜和凝胶，弃去凝胶。
2. 将薄膜漂在氨基黑中快速染色，直至分子量标准显现时取出，记录下标准位置。
3. 用100ml水洗涤纤维素膜，必要时可用脱色缓冲液。
4. 膜置印迹缓冲液中于37℃保温1小时。
5. 室温下，用PBS-Tween缓冲液洗涤薄膜。
6. 用封口机将薄膜封入塑料袋中，尽可能不留空气。
7．袋的一角剪一缓冲液的小口，用透析袋夹紧。
8．混合：NGS(100微升)，印迹缓冲液中的抗体（10毫升），加在装薄膜的袋中，于室温下摇动2小时（或4℃过夜）
9．用总体积300ml PBS-Tween缓冲液，分4次在一浅盘中洗涤薄膜，每次75ml。
10. 将连接生物素的羊抗兔IgG（40微升溶于10毫升印迹缓冲液/100微升 NGS）加在袋内，于室温下摇动1小时。
11．按步骤9洗涤。
12．加入抗生素蛋白-HRP（40微升溶于10毫升印迹缓冲液/100微升 NGS），于室温下摇动。
注意事项：
western blot中转移在膜上的蛋白处于变性状态，空间结构改变，因此那些识别空间表位的抗体不能用于western blot检测。这种情况可以将表达目的蛋白的细胞或细胞裂解液中的所有蛋白先生物素化，再用酶标记亲和素进行western blot。实验中取胶和膜需带手套。
Western可以参考如下步骤进行操作。
1.收集蛋白样品(Protein sample preparation)
可以使用适当的裂解液，例如碧云天生产的Western及IP细胞裂解液，裂解贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品。对于某些特定的亚
细胞组份蛋白，例如细胞核蛋白、细胞浆蛋白、线粒体蛋白等，可以参考相关文献提取这些亚细胞组份蛋白，也可以使用试剂盒
进行抽提，例如碧云天生产的细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒。
收集完蛋白样品后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。根据所使用的裂解液的不同，需要
采用适当的蛋白浓度测定方法。因为不同的蛋白浓度测定方法对于一些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很大。如果使用碧云天生
产的Western及IP细胞裂解液，可以使用BCA蛋白浓度测定试剂盒。
2. 电泳(Electrophoresis)
(1) SDS-PAGE凝胶配制
SDS-PAGE凝胶可以参考一些文献资料进行配制，也可以使用碧云天生产的SDS-PAGE凝胶配制试剂盒。该试剂盒提供了除水和配
胶器具外的所有试剂以及配制各种浓度SDS-PAGE的配方。
(2) 样品处理
在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。使用5X的SDS-PAGE蛋
白上样缓冲液可以减小上样体积，在相同体积的上样孔内可以上样更多的蛋白样品。5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以参考相关文献资料配制，也可以使用碧云天生产的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5X)。
100℃或沸水浴加热3-5分钟，以充分变性蛋白。
(3) 上样与电泳
冷却到室温后，把蛋白样品直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内即可。
为了便于观察电泳效果和转膜效果，以及判断蛋白分子量大小，最好使用预染蛋白质分子量标准。
电泳时通常推荐在上层胶时使用低电压恒压电泳，而在溴酚蓝进入下层胶时使用高电压恒压电泳。对于Bio-Rad的标准电泳装置
或类似电泳装置，低电压可以设置在80-100V，高电压可以设置在120V左右。SDS-PAGE可以采用普通的电泳仪就可以满足要求，
也可以采用碧云天的多功能电泳仪(带定时)。为了电泳方便起见，也可以采用整个SDS-PAGE过程恒压的方式，通常把电压设置在
100V，然后设定定时时间为90－120分钟。设置定时可以避免经常发生的电泳过头。
通常电泳时溴酚蓝到达胶的底端处附近即可停止电泳，或者可以根据预染蛋白质分子量标准的电泳情况，预计目的蛋白已经被适
当分离后即可停止电泳。
3. 转膜(Transfer)
我们推荐在Western实验中选用PVDF膜。硝酸纤维素膜(NC膜)也可以使用，但硝酸纤维素膜比较脆，在操作过程中特别是用镊子
夹取等过程中容易裂开。膜的使用请参考生产商的推荐使用步骤。
通常如果使用Bio-Rad的标准湿式转膜装置，可以设定转膜电流为300-400mA，转膜时间为30-60分钟。也可以在15-20mA转膜过
夜。转膜时也可以使用碧云天的多功能电泳仪(带定时)。具体的转膜时间要根据目的蛋白的大小而定，目的蛋白的分子量越大，
需要的转膜时间越长，目的蛋白的分子量越小，需要的转膜时间越短。
在转膜过程中，特别是高电流快速转膜时，通常会有非常严重的发热现象，最好把转膜槽放置在冰浴中进行转膜。
转膜的效果可以观察所使用的预染蛋白质分子量标准，通常分子量最大的1-2条带较难全部转到膜上。转膜的效果也可以用丽春
红染色液对膜进行染色，以观察实际的转膜效果。也可以用考马斯亮蓝快速染色液对完成转膜的SDS-PAGE胶进行染色，以观察蛋
白的残留情况。
4. 封闭(Blocking)
转膜完毕后，立即把蛋白膜放置到预先准备好的Western洗涤液中，漂洗1-2分钟，以洗去膜上的转膜液。从转膜完毕后所有的步
骤，一定要注意膜的保湿，避免膜的干燥，否则极易产生较高的背景。
用微型台式真空泵吸尽洗涤液，加入Western封闭液，在摇床上缓慢摇动,室温封闭60分钟。对于一些背景较高的抗体，可以在
4℃ 封闭过夜。在整个Western过程中我们推荐使用碧云天生产的侧摆摇床，侧向摆动速度比较缓慢，而且也容易让溶液覆盖蛋
白膜。
5. 一抗孵育(Primary antibody incubation)
参考一抗的说明书，按照适当比例用Western一抗稀释液稀释一抗。
用微型台式真空泵吸尽封闭液，立即加入稀释好的一抗，室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。如果一抗孵育一小时效果
不佳，可以在4℃缓慢摇动孵育过夜。
回收一抗。加入Western洗涤液，在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤5-10分钟。吸尽洗涤液后，再加入洗涤液，洗涤5-10分钟。共洗涤
3次。如果结果背景较高可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。
6. 二抗孵育(Secondary antibody inucubation)
参考二抗的说明书，按照适当比例用Western二抗稀释液稀释辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗。
用微型台式真空泵吸尽洗涤液，立即加入稀释好的二抗，室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。
回收二抗。加入Western洗涤液，在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤5-10分钟。吸尽洗涤液后，再加入洗涤液，洗涤5-10分钟。共洗涤
3次。如果结果背景较高可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。
7. 蛋白检测(Detection of proteins)
参考相关说明书，使用BeyoECL, Western 荧光检测试剂等ECL类试剂来检测蛋白。
洗片时可以使用X光片自动洗片机。如果没有自动洗片机，可以用显影定影试剂盒自行配制显影液和定影液进行手工洗片。
8. 膜的重复利用(Membrane recovery)
如果蛋白样品非常宝贵，可以使用Western一抗二抗去除液处理蛋白膜，以重复利用蛋白膜。
western blot的具体步骤
(PS 楼主可以百度嘛，网上关于WB的实验太多了)Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。一、原理 与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。二、试剂准备1、SDS-PAGE试剂:见电泳实验。2、匀浆缓冲液：1.0M Tris-HCl(pH 6.8)1.Oml；10%SDS 6.0ml；β-巯基乙醇 0.2ml；ddH2O 2.8ml。3、转膜缓冲液：甘氨酸 2.9g；Tris 5.8g；SDS 0.37g；甲醇200ml；加ddH2O定容至1000ml。4、0.01M PBS(pH7.4)：NaCl 8.0g；KCl 0.2g；Na2HPO4 1.44g；KH2PO4 0.24g；加ddH2O至1000ml。5、膜染色液：考马斯亮兰 0.2g；甲醇80ml；乙酸2ml；ddH2O118 ml。包被液（5%脱脂奶粉，现配）：脱脂奶粉1.0g 溶于20ml的0.01M PBS中。6、显色液：DAB 6.0mg；0.01M PBS 10.0ml；硫酸镍胺 0.1ml；H202 1.0μl。三、操作步骤（一）蛋白质样品获得：细菌诱导表达后，可通过电泳上样缓冲液直接裂解细胞，真核细胞加匀浆缓冲液，机械或超声波室温匀浆0.5-1min。然后4℃，13,000g离心15min。取上清液作为样品。（二）电泳：制备电泳凝胶，进行SDS-PAGE。（三）转移：（半干式转移）1、电泳结束后将胶条割至合适大小，用转膜缓冲液平衡，5min×3次。2、膜处理：预先裁好与胶条同样大小的滤纸和NC膜，浸入转膜缓冲液中10min。3、转膜：转膜装置从下至上依次按阳极碳板、24层滤纸、NC膜、凝胶、24层滤纸、阴极碳板的顺序放好，滤纸、凝胶、NC膜精确对齐，每一步去除气泡，上压500g重物，将碳板上多余的液体吸干。接通电源,恒流1mA/cm2，转移1.5hr。转移结束后，断开电源将膜取出,割取待测膜条做免疫印迹。将有蛋白标准的条带染色，放入膜染色液中50s后，在50%甲醇中多次脱色，至背景清晰，然后用双蒸水洗，风干夹于两层滤纸中保存，留与显色结果作对比。（四）免疫反应：1、用0.01M PBS洗膜，5min ×3次。2、加入包被液，平稳摇动，室温2hr。3、弃包被液，用0.01M PBS洗膜，5min×3次。4、加入一抗（按合适稀释比例用0.01M PBS稀释，液体必须覆盖膜的全部），4℃ 放置12hr以上。阴性对照，以1%BSA取代一抗，其余步骤与实验组相同。5、弃一抗和1%BSA，用0.01M PBS分别洗膜，5min×4次。6、加入辣根过氧化物酶偶联的二抗（按合适稀释比例用0.01M PBS稀释），平稳摇动，室温2hr。7、弃二抗，用0.01M PBS洗膜，5min×4次。8、加入显色液，避光显色至出现条带时放入双蒸水中终止反应。四、注意事项1、一抗、二抗的稀释度、作用时间和温度对不同的蛋白要经过预实验确定最佳条件。2、显色液必须新鲜配置使用，最后加入H2O2。3、DAB有致癌的潜在可能，操作时要小心仔细
Western-blot实验ECL发光检测实验步骤
ECL Western特异发光检测试剂盒用于辣根过氧化物酶(HRP)标记的蛋白或核酸检测。下面以engreen的超敏型ECL发光液Enlight-Plus为例，说一下检测实验步骤。 1. 常规电泳、转膜、HRP 标记抗体或核酸探针孵育、洗膜。以下操作在室温进行。 注意：Enlight-Plus 推荐的抗体稀释度为: 储存液浓度为1mg/ml 的一抗推荐稀释度 储存液浓度为1mg/ml 的二抗推荐稀释度 1:1000-1:5000 或 0.2-1.0μg/ml 1:2000-1:10,000 或10-50ug/ml 2. 新鲜配制发光工作液。将BufferA 和Buffer B 按1:1 比率混合，制成发光工作液(每1cm2膜需要0.125ml 发光工作液)。转移到清洁的塑料小盒中。 3. 用镊子将漂洗过的膜取出，将膜的下缘与滤纸轻轻接触以除去膜上多余的洗液，但勿使膜完全干燥。将膜转移至有发光工作液的塑料小盒中，使其完全浸泡，轻轻摇晃，室温孵育几十秒到1 分钟。 4. 用镊子将膜夹起5-10 秒，并将膜的下缘与滤纸轻轻接触以除去膜上多余的发光液，迅速将膜完全包裹于洁净保鲜膜内，去除气泡和褶皱，蛋白面朝上固定于X 片暗盒内。 5. 在黑暗中一次重叠放入3 张X 光胶片，30 分钟或更长时间后全部取出显影。 6. 对同一张膜进行多次蛋白杂交：用PBST 或TBST 洗涤掉发光液（10min×3 次），然后从开始一抗杂交即可。 Western-blot中ECL发光液的选择很重要，Enlight-Plus检测级别可达pg级，发光时间长，背景低，得到的图像很漂亮，非常有利于实验的进行。
