本文目录
- DAP-seq（DNA亲和纯化测序）技术常见问题（input是什么）
- 高通量测序的实验过程
- 小白的生信笔记（1）——高通量测序的一些基础知识
- 基因测序的步骤是什么
- 病毒的RNA测序是怎么测出来的
- 易基因｜全基因组DNA甲基化测序分析全流程
DAP-seq（DNA亲和纯化测序）技术常见问题（input是什么）
DAP-SEQ技术简介 DAP-SEQ是基于DNA亲和纯化，通过体外表达转录因子鉴定TFBS的技术，具有不受抗体和物种限制，且高通量的优势，自该技术问世以来，已被广泛应用于转录调控和表观组学的研究。 那么关于DAP-SEQ都有哪些问题需要关注呢？ 1. DAP-seq原理、技术流程，能解决什么样的问题? 原理：体外表达的蛋白和DNA进行亲和纯化，将与蛋白结合的DNA洗脱后进行高通量测序。 技术流程：将编码转录因子的CDS序列构建到含有亲和标签的载体中，构建蛋白表达载体，进行体外蛋白表达，形成转录因子和亲和标签的融合蛋白；提取样品的基因组DNA，构建DNA文库，然后将体外表达的带有亲和标签的转录因子和DNA文库进行结合，随后把结合的DNA洗脱后上机测序。 能帮助您快速找到转录因子的结合位点，寻找转录因子调控的靶基因。 蓝景科信DAP-seq流程：2. 需要提供什么材料？ 需要您提供： （1）组织材料或者是提取好的基因组DNA； （2）含有转录因子CDS序列的质粒。 3. 分析结果包括哪些内容？ 蓝景科信DAP-seq的生信分析包括以下内容： 1.对原始数据进行去除接头、污染序列及低质量 reads 的处理 2.数据产出统计 3.参考序列比对分析 4.测序reads富集区域扫描（peak calling） 5.Peak长度分布统计 6.Peak在基因功能元件上的分布统计 7.Peak序列模式发掘（motif search） 8.已知motif注释 9.Peak相关基因鉴定 10.Peak相关基因的GO和KEGG富集分析 11.测序数据的差异分析（》=2个样本） 12.测序数据的可视化分析 4.实验的成功率怎么样？ 不同转录因子家族的成功率不同，请参考不同转录因子家族的DAP-seq成功率：5. 为什么有些基因家族的成功率很低？ 有些转录因子需要和其他蛋白形成复合体才能与DNA结合，这些蛋白的风险比较高。 6. 一些特殊的样品能不能做，有没有风险？ 有两种情况的样品是不能做DAP-seq 实验的，一种情况是没有参考基因组，另一种情况是转录因子不能在体外表达出来，除此之外，我们会做可行性分析报告供您参考。 7. 包含重复吗？ 包含两个技术重复。 8. 做这个蛋白表达的时候，使用的什么表达系统？ 优先使用真核表达系统进行蛋白表达，如果真核表达系统不能表达成功的话可以沟通换用原核表达系统。 9. 植物组织样本取样的时期部位有什么要求？ 植物组织样本取样的时期和部位是您根据自己的研究需求确定，不同组织和时期DNA的修饰不同，可能会影响蛋白和DNA的结合。 10. DAP-seq跟ChIP-seq有何区别,DAP-seq的优势表现在哪里? DAP-seq和ChIP-seq的区别： AP-seq的优势：不需要针对每个转录因子制备特异性抗体，快速、高通量、节约时间成本。 11. DAP-seq用的input是什么，为什么选这个作为对照呢？ Input对照是用的亲和纯化前的文库，目的是降低背景噪音，我们用的Input和2016年发表在Cell（DAP Seq-Cistrome and Epicistrome Features Shape the Regulatory DNA Landscape）上的论文是一致的。 12. 为什么实验中表达的有些蛋白比理论值偏大？ 很多蛋白表达出来比理论值大一些，因为有一些翻译后修饰，很多情况都是这样的，原核表达也有这类情况，比如拟南芥SnRK蛋白激酶，预测40 kd，通过原核表达，实际分子量是60 kd。
高通量测序的实验过程
1.样本准备（sample fragmentation）2.文库构建(library preparation)3.测序反应(sequencing reaction)4.数据分析(data analysis)
小白的生信笔记（1）——高通量测序的一些基础知识
1977年，英国化学家桑格（Frederick Sanger）发明了双脱氧链终止法，这个技术以及吉尔伯特（W.Gilbert)发明的化学降解法被称为一代测序技术。 Sanger法测序利用一种DNA聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物。直到掺入一种链终止核苷酸为止。每一次序列测定由一套四个单独的反应构成，每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止。终止点由反应中相应的双脱氧而定。每一种dNTPs和ddNTPs的相对浓度可以调整，使反应得到一组长几百至几千碱基的链终止产物。它们具有共同的起始点，但终止在不同的的核苷酸上，可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段，凝胶处理后可用X-光胶片放射自显影或非同位素标记进行检测。 不同于一代测序，NGS采用的是边合成边测序的策略，主要的技术路线以Roche公司的454技术、illumina公司的Solexa，Hiseq技术和ABI公司的Solid技术为代表。为了增强测序准确性，需要对同一模板通过PCR扩增多个拷贝来矫正偏差值。因此整个测序分为PCR扩增（一种可以快速复制大量产生相同DNA片段的技术）和测序两个步骤。但是PCR过程会一定程度增加系统的错误率，并且带来的错误具有偏向性，这也是二代技术存在的问题之一。 illumina公司主打产品MiSeq测序仪、HiSeq X Ten测序仪、Miseq FGx测序仪、NextSeq 500/550桌上型测序仪、MiniSeq台式测序仪等，涵盖了不同的应用场景的不同需求。 第二代测序技术测序平台和测序成本，测序费用，花费时间，建库等实验技术难度，错误率以及读长（150-400bp），分析工作的体量，对于满足更高的科研需求和在医疗诊断中的普及都是不小的阻碍。其PCR过程带来的误差和偏好或成为其在医疗诊断大规模运用的阻碍。三代技术主要解决二代测长较短的问题。 PacBio 的SMRT 技术，LifeTechnologies 的 IonTorrent 半导体测序技术和 Oxford NanoporeTechnologies 纳米孔单分子测序技术是三代测序技术的代表。 PacBio SMR PacBio的SMRT仍然运用边合成边测序的策略，但是其超强活性的DNA聚合酶是实现超长读长（~1000bp）的关键。反应在纳米管中进行，方便达到超高通量的目的。利用的是ZMW（零模波导孔）原理在超小的纳米孔中区别荧光信号的背景。其测序速度很快，每秒约10个dNTP。目前的问题在于测序的错误率太高（81-83%），这也是大多数三代技术需要解决的共同问题。不过错误随机，几乎没有偏向性，为其通过矫正来减少错误率提供了可能。目前这个技术已经投入市场。 Oxford Nanopre MinlON 而Nanopore的MinlON测序仪应用纳米孔单分子技术，这是一种基于电信号的测序技术，比起其他的光信号测序技术来说是一个革新。技术核心是一种特殊的内有分子接头的纳米孔，由蛋白质小孔嵌在人造膜上形成。膜两侧加上电压，使电流通过小孔。当不同的DNA碱基通过纳米孔时，其对电流的阻碍作用短暂地影响流过纳米孔的电流强度，不同碱基影响的程度不同，这种差异被灵敏的电子设备捕捉从而鉴定所通过的碱基种类。这种技术的优点很多，读长长（大约在几十kb，甚至100 kb），错误随机，而不是聚集在读取的两端，通量较高，该公司也在努力简化样品制备流程。理论上运用这个技术RNA也可以直接测序，还能检测到甲基化的胞嘧啶。不过不能实现理想的错误率控制，或成为其投入市场的阻碍。 LifeTechnologies IonTorrent IonTorrent 使用半导体芯片，在芯片的微孔中固定DNA链。依次加入AGCT的碱基，DNA合成时如果碱基可以结合到模板链则会释放一个氢离子。这个氢离子导致局部HP值发生变化。离子传感器检测到PH 变化后，便将化学信号转变为序列信息。而如果DNA 链有两个连续的相同碱基，则记录到的信号翻倍，从而将其识别。如果不匹配，则记录不到变化。这种技术由于不涉及荧光激发和拍照，则运行时间被大大缩减（仅数小时），无需激光光源，光学系统和照相系统，也不需要荧光标记，规避了这些环节带来的误差。但是其读长不算太长（200bp），并且当遭遇多个连续的相同碱基时，强烈的PH变化会带来误差。 de novo测序也称为从头测序：其不需要任何现有的序列资料就可以对某个物种进行测序，利用生物信息学分析手段对序列进行拼接，组装，从而获得该物种的基因组图谱。 外显子组测序是指利用序列捕获技术将全基因组外显子区域DNA捕捉并富集后进行高通量测序的基因组分析方法。外显子测序相对于基因组重测序成本较低，对研究已知基因的SNP、Indel等具有较大的优势，但无法研究基因组结构变异如染色体断裂重组等。 Magenomics研究的对象是整个微生物群落。相对于传统单个细菌研究来说，它具有众多优势，其中很重要的两点：(1)微生物通常是以群落方式共生于某一小生境中，它们的很多特性是基于整个群落环境及个体间的相互影响的，因此做Metagenomics研究比做单个个体的研究更能发现其特性；(2) Metagenomics研究无需分离单个细菌，可以研究那些不能被实验室分离培养的微生物。 单核苷酸多态性singlenucleotide polymorphism，SNP 或单核苷酸位点变异SNV。个体间基因组DNA序列同一位置单个核苷酸变异(替代、插入或缺失)所引起的多态性。不同物种、个体基因组DNA序列同一位置上的单个核苷酸存在差别的现象。有这种差别的基因座、DNA序列等可作为基因组作图的标志。人基因组上平均约每1000个核苷酸即可能出现1个单核苷酸多态性的变化，其中有些单核苷酸多态性可能与疾病有关，但可能大多数与疾病无关。单核苷酸多态性是研究人类家族和动植物品系遗传变异的重要依据。在研究癌症基因组变异时，相对于正常组织，癌症中特异的单核苷酸变异是一种体细胞突变，称做SNV。 基因组上小片段（《50bp）的插入或缺失，形同SNP/SNV。 当基因组发生某一段的缺失，或转录组的剪接，在测序过程中，横跨缺失位点及剪接位点的reads回帖到基因组时，一条reads被切成两段，匹配到不同的区域，这样的reads叫做soft-clipped reads，这些reads对于鉴定染色体结构变异及外源序列整合具有重要作用。 由于大部分测序得到的reads较短，一个reads能够匹配到基因组多个位置，无法区分其真实来源的位置。一些工具根据统计模型，如将这类reads分配给reads较多的区域。 拼接软件基于reads之间的overlap区，拼接获得的序列称为Contig（重叠群）。 基因组de novo测序，通过reads拼接获得Contigs后，往往还需要构建454 Paired-end库或Illumina Mate-pair库，以获得一定大小片段（如3Kb、6Kb、10Kb、20Kb）两端的序列。基于这些序列，可以确定一些Contig之间的顺序关系，这些先后顺序已知的Contigs组成Scaffold。 Reads拼接后会获得一些不同长度的Contigs。将所有的Contig长度相加，能获得一个Contig总长度。然后将所有的Contigs按照从长到短进行排序，如获得Contig 1，Contig 2，Contig 3...…Contig 25。将Contig按照这个顺序依次相加，当相加的长度达到Contig总长度的一半时，最后一个加上的Contig长度即为Contig N50。举例：Contig 1+Contig 2+ Contig 3+Contig 4=Contig总长度*1/2时，Contig 4的长度即为Contig N50。Contig N50可以作为基因组拼接的结果好坏的一个判断标准。 Scaffold N50与Contig N50的定义类似。Contigs拼接组装获得一些不同长度的Scaffolds。将所有的Scaffold长度相加，能获得一个Scaffold总长度。然后将所有的Scaffolds按照从长到短进行排序，如获得Scaffold 1，Scaffold 2，Scaffold 3...……Scaffold 25。将Scaffold按照这个顺序依次相加，当相加的长度达到Scaffold总长度的一半时，最后一个加上的Scaffold长度即为Scaffold N50。举例：Scaffold 1+Scaffold 2+ Scaffold 3 +Scaffold 4 +Scaffold 5=Scaffold总长度*1/2时，Scaffold 5的长度即为Scaffold N50。Scaffold N50可以作为基因组拼接的结果好坏的一个判断标准。 测序深度是指测序得到的总碱基数与待测基因组大小的比值。假设一个基因大小为2M，测序深度为10X，那么获得的总数据量为20M。覆盖度是指测序获得的序列占整个基因组的比例。由于基因组中的高GC、重复序列等复杂结构的存在，测序最终拼接组装获得的序列往往无法覆盖有所的区域，这部分没有获得的区域就称为Gap。例如一个细菌基因组测序，覆盖度是98%，那么还有2%的序列区域是没有通过测序获得的。 用测序的数据组装成转录本。有两种组装方式：1，de-novo构建； 2，有参考基因组重构。其中de-novo组装是指在不依赖参考基因组的情况下，将有overlap的reads连接成一个更长的序列，经过不断的延伸，拼成一个个的contig及scaffold。常用工具包括velvet，trans-ABYSS，Trinity等。有参考基因组重构，是指先将read回贴到基因组上，然后在基因组通过reads覆盖度，junction位点的信息等得到转录本，常用工具包括scripture、cufflinks。 比较基因组学(ComparativeGenomics)是基于基因组图谱和测序基础上，对已知的基因和基因组结构进行比较，来了解基因的功能、表达机理和物种进化的学科。利用模式生物基因组与人类基因组之间编码顺序上和结构上的同源性，克隆人类疾病基因，揭示基因功能和疾病分子机制，阐明物种进化关系，及基因组的内在结构 Q30是指一个碱基的识别可靠性等于99.9%，或者说出错可能性是0.1%。Q20则是指碱基识别的可靠性等于99%。Q30数据量是指一批数据中，质量高于等于Q30的数据的量的总和。 PF是pass filter的意思。也就是质量合格的意思。Illumina的测仪序会自动地对一个read(序列)的质量可靠性进行打分。对于前25个碱基中的是否有两个碱基的识别可靠性低于0.6，是PF的判断标准。这句话翻译成较容易理解的话: 就是前25个碱基中，如果低质量的数据有2个或更多，则这条read被判定为不合格，PF就不通过。反之，则质检通过。 PF是国际公认的质检标准。对于哺乳动物基因组重测序、外显子测序，我们保证数据质量是Q30的比例高于80%。对于mRNA测序，smRNA测序，我们保证对照Lane的数据质量是Q30的比例高于80%。 一般情况下: 哺乳动物基因组重测序、外显子测序，GC比例在40%左右，Q30的比例是80~95%； RNA-seq，GC比例在50%左右，Q30的比例是~80%。如果Poly(A)特别多的情况下，Q30会更低一些； SmRNA-seq，因为有许多的read读通之后，只剩下一串的A，质量会更低，我们的实验结果%Q30在70~75%。 Illumina的测序仪的数据产量高，数据质量也是最高的。因为采用带终止基团的荧光dNTP，所以在测Homopolyer（碱基同聚物，例如一串4个T：TTTT）等的时候，不会产生移码错读。 Roche 454采用的是pyrosequencing的测序原理，通过水解DNA全成过程中所产生的焦磷，放出光，通过测这光来读出序列。优点是读长最长。但是数据产量是最低的。 Ion Torrent，包括PGM和Proton，采用测量DNA合成过程中所释放的氢离子引起的PH值的变化，来得到序列。优点是速度最快，上机前约3~4天的时间，上机只要2~4个小时。 SOLID采用的是杂交，连接反应，再测荧光的方法。因为杂交，所以速度慢，测长较短。现在事实上已被淘汰。 PacBio是三代测序，也就是单分子测序。目前的情况是测序长度可以在1个KB以上，而且可以测出DNA序列的修饰情况。但是其缺点在于测序的准确度很低，目前的测序准确度只有每个碱基80~90%。另一方面通量较小，一次读7万条rea
基因测序的步骤是什么
PCR产物直接测序技术现已成为分子生物学和基因组学研究中的一个重要技术,广泛用于基因突变检测、遗传性疾病诊断、单核苷酸多态性研究、基因组重叠序列群等.与传统克隆测序技术相比较,直接对PCR扩增的DNA进行测序,省去了耗时的克隆步骤,避免了传统的细菌培养,模板提取等重复性操作,可以从少量的原始样品中得到正确的DNA序列信息.PCR产物直接测序技术具有快速、简便、稳定经济的优点. 试验试剂 PCR扩增的双链DNA模板 长约20个核苷酸的DNA引物 DNA聚合酶 测序胶 0.1mol/L DDT α-32P-dATP dNTP/ddNTP混合物(80μmol/L/8μmol/L) dNTP(dCTP、dGTP 、dTTP 各0.75μmol/L) 测序反应缓冲液：40mmol/L Tris-HCl(pH7.5),20mmol/L MgCl2,50mmol/L NaCl 终止缓冲液：95% 甲酰胺,20mmol/L EDTA,0.05% 溴酚蓝,0.05% 二甲苯腈 试验步骤： 1、 4个微量离心管中各加入dNTP/ddNTP混合物2.5μl,混合物37OC温浴5min,备用. 2、 在一个空的微量离心管中加入1pmol的PCR扩增双链DNA,10pmol测序引物,2μl 5×测序缓冲液,加双蒸水至总体积10μl,96OC加热8min,冰浴泠却1min,4OC 10000g离心10s. 3、 加入2μl预冷的标记混合物(dCTP、dGTP 、dTTP 各0.75μmol/L),α-32P-dATP 5μCi,1μl 0.1mol/L DDT,测序酶2U,加水至15μl,混匀后置冰上2min,标记新合成的DNA链. 4、 在第1步骤的4个管中各加入3.5μl标记反应混合物,37OC温浴5min.每管各加入4μl终止液. 5、 样品在80OC的水浴中热变性5min,每一泳道加2μl 加到测序胶上,电泳分离这些片段. 注意事项： 1.?PCR产物要有一定的长度(》200bp),因为测序结果两端20-30bp的电泳峰图的准确性较低. 2.?纯化PCR产物可通过离子交换层析使扩增的DNA段与反应剩余的dNTP及引物分离；也可通过琼脂糖凝胶电泳,将PCR产物与非特异性扩增产物和引物分离开来；如果扩增的特异性较高时,可直接通过酚：氯仿抽提,乙醇沉淀的方法来纯化. 3.?测序引物设计原则类似于PCR引物设计,可在DNA合成仪上合成20个左右的核苷酸作为引物,经过高压液相层析或聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化后,即可用作测序引物. PCR循环测序法 PCR循环测序法是将PCR扩增和核酸序列分析技术相结合,从而形成的一种测定核苷酸序列的研究方法,也称作线性扩增测序.该方法采用PCR仪加热使DNA模板变性,在TaqDNA聚合酶作用下,以温度循环模式在模板上进行多轮的双脱氧核苷酸测序反应,线性扩增标记的DNA分子. PCR循环测序法与以往的测序方法相比,其优点在于：大大减少所需的模板量；能提高测序反应产生的信号,降低了操作的复杂性,且聚合酶的用量减少；可在小量制备的模板上进行筛选反应；高温下进行的测序反应使DNA聚合酶催化的聚合反应能够通过模板二级结构的区域；双链闭环DNA可以直接作为反应模板应用,不用作预先碱变性处理.由于PCR循环测序法能够简单、快速地检测特定序列,因此, PCR循环测序法在核酸序列分析研究中受到广泛的重视. 试验试剂： DNA测序试剂盒 dNTP ddNTP 丙烯酰胺 双丙烯酰胺 尿素 TEMED(N,N,N‘,N’-四甲基乙二胺) 过硫酸铵 6%测序胶：6%丙烯酰胺,7mmol/L 尿素,1×TBE. 10×测序缓冲液：100mmol/L Tris-HCl(pH8.8),500mmol/L KCl,40mmol/L MgCl2,0.01%明胶,20μmol/L dATP,50μmol/L dCTP,50μmol/L dGTP,50μmol/L dTTP 终止混合液：ddATP (600μmol/L),ddCTP (600μmol/L),ddGTP (100μmol/L),ddTTP(1000μmol/L) 终止缓冲液：95%甲酰胺,20mmol/L EDTA,0.05%溴酚蓝,0.05%二甲苯腈 试验步骤 1、 4个小离心管,每个小管加入3μl的终止混合液,将管子放在冰上. 2、 在DNA模板中加入引物(4pmol), 4μl 10×测序缓冲液, 10μlα-32P-dATP, 2U TaqDNA聚合酶,加双蒸水到30μl彻底混匀,每管7μl加入上面4个小管中. 3、 反应液上加30μl的石蜡油. 4、 95OC 30S,50OC 30S,72OC 60S共30个循环,可根据具体的情况进行适当的调整循环条件及循环次数. 5、 反应结束后在油层下加入5μl的终止缓冲液并用加样枪混匀. 6、 上样前将样品在大于80OC的水浴中热变性5min,每一道加2μl加到测序胶上,电泳分离这些片段. 注意事项： 1、 制备测序模板：PCR 扩增的产物可以经过低熔点的琼脂糖凝胶电泳纯化回收后,用于序列分析；可经过柱层析纯化,去除PCR 反应后剩余的dNTP和引物后,用于序列分析.PCR 产物也可不经纯化直接用于测序,但是这种测序产生的结果较差,建议测序之前应进行PCR产物的纯化.各种标准的质粒制备方法所纯化出的质粒均可作为测序模板使用.用标准方法制备的M13噬菌体、粘粒、λDNA都适合用作测序模板用.但要注意的是反应体系中不应有与引物互补的非目的基因序列,否则将会导致测序实验的失败. 2、 测序引物：测序引物是指合成的与测序模板链特异性互补的寡核苷酸序列.可用α-32P-dATP和T4多聚核苷酸激酶对引物的5‘端进行标记,反应体系中引物、激酶和α-32P-dATP要保持在最佳的比例,以得到高比活性的标记引物；也可用α-32P-dATP标记新合成的DNA链.引物的浓度不宜高,否则容易形成引物二聚体,或产生非特异性的扩增引物. 3、 酶：各种缺乏3‘—5‘端外切活性的耐热DNA聚合酶都可以用于循环测序,其中TaqDNA聚合酶在DNA测序中最为常用.虽然应用PCR循环测序法能够简单、快速的进行基因序列的测定,但仍未能适应大规模DNA序列测定的需要,而PCR循环测序法、荧光标记和自动测序仪的联合使用成为大规模基因组测序的主要技术.该技术是采用荧光标记引物或双脱氧核苷三磷酸,反应产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳后,经特定的DNA序列分析仪和分析系统处理待测的DNA序列.它的应用减轻了DNA序列测定的工作量,提高了测序的效率.
病毒的RNA测序是怎么测出来的
先提取病毒RNA，然后RNA反转录为双链cDNA,后面就是常规高通量测序的流程了，加接头建库上机测序，就可以知道cDNA序列信息，最后反推为RNA序列，就得到病毒RNA序列信息
易基因｜全基因组DNA甲基化测序分析全流程
全基因组DNA甲基化实验怎么做？从技术原理、建库测序流程、信息分析流程和研究套路等四方面详细介绍。表观修饰不需要改变 DNA 序列便能实现对性状的改变，表观修饰的改变与基因功能乃至细胞状态、发育、衰老、疾病等存在重要的关联。在众多的表观遗传修饰中，最为重要且研究最为广泛的修饰之一是 DNA 甲基化，而全基因组甲基化测序（WGBS-seq）无疑是最有效的研究手段。 全基因组甲基化测序利用重亚硫酸盐能够将未甲基化的胞嘧啶（C）转化为胸腺嘧啶 （T）的特性，将基因组用重亚硫酸盐处理后测序，即可根据单个 C 位点上未转化为 C 未转化为 T 的 reads 数目与所有覆盖的 reads 数目的比例，计算得到甲基化率。该技术对于全面研究胚胎发育、衰老机制、疾病发生发展的表观遗传机制，以及筛选疾病相关的表观遗传学标记位点具有重要的应用价值。 全基因组甲基化测序原理示意图入下：样品检测——样品打断 ——文库构建——BS处理——文库质检 （一）样品检测 对DNA样品的检测主要包括2种方法： （1）琼脂糖凝胶电泳分析DNA降解程度以及是否有污染，检测具有明显的主带，且条带清晰； Qubit 2.0对DNA浓度进行精确定量，DNA检测总量不低于1ug。 （二）文库构建 样本检测合格后，使用Bioruptor系统将1µg样品基因组DNA与未甲基化的lambda DNA混合，然后将其片段化，平均大小约为250bp。片段化后，纯化的随机片段化DNA随后用T4 DNA聚合酶，Klenow片段和T4多核苷酸激酶的混合物进行修复，钝化和磷酸化末端。随后使用Klenow片段（3’-5’exo-）对钝的DNA片段进行3’腺苷酸化，然后与连接5’-甲基胞嘧啶而不是使用T4 DNA连接酶的胞嘧啶连接的衔接子进行连接。完成每个步骤后，使用磁珠纯化DNA。之后，根据说明使用ZYMO EZ DNA甲基化金试剂盒将未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶。最后，用JumpStart Taq DNA聚合酶进行PCR扩增，再使用磁珠对PCR产物进行纯化获得最终文库。 （三）文库质检 文库构建完成后，先使用Qubit2.0进行初步定量，稀释文库至1ng/ul，随后使用Agilent 2100对文库的insert size进行检测，insert size符合预期后，使用qPCR方法对文库的有效浓度进行准确定量（文库有效浓度》 2nM），以保证文库质量。 （四）上机测序 文库检测合格后，把不同文库按照有效浓度及目标下机数据量的需求pooling后在illumina Nova平台测序，测序策略为PE150。（一）原始下机数据质控 原始下机数据为FASTQ格式，是高通量测序的标准格式。FASTQ文件每四行为一个单位，包含一条测序序列（read）的信息。该单位第一行为read的ID，一般以@符号开头；第二行为测序的序列，也就是reads的序列；第三行一般是一个+号，或者与第一行的信息相同；第四行是碱基质量值，是对第二行序列的碱基的准确性的描述，一个碱基会对应一个碱基质量值，所以这一行和第二行的长度相同。以下为一条read信息的示例：原始下机数据包含建库时引进的接头序列以及质量过低的碱基，这些因素会导致后续比对到基因组的reads较少，从而导致得到的信息较少，因此需要进行过滤。利用trim_galore软件对原始数据进行去除接头序列及低质量碱基等质控步骤。 （二）序列比对 经过质控的reads需要根据与参考基因组的序列相似度比对到参考基因组上。相比于常规基因组及转录组测序，WGBS测序方法产生的数据的特点决定其在比对时存在三大困难： （1）DNA片段正链和负链经过重亚硫酸盐转化后将不再反向互补，再经过PCR，便会产生四条不同的序列，这将大大增加比对时的计算量。 （2）经过重亚硫酸盐转化后，DNA序列大部分C碱基被转化成T碱基，因此序列含大量T而缺乏C；经过PCR后，产生的互补链则含有大量A而缺乏G。这样便导致序列的复杂度降低（即序列的组成特征更单一），从而增加比对的难度。 （3）C和T的比对是不对称的。经过重亚硫酸盐转化后，序列中非甲基化的C碱基（占大部分）被转化为T，这将导致测序序列与参考基因组不匹配，T既可能应该比对到T上，有可能应该比对到C上；而C则只能比对到C上。这也增加了比对的难度。 利用BSMAP软件进行比对。BSMAP进行比对时，先以参考基因组上C碱基的位置作为指导，将reads中对应参考基因组C碱基位置的T标记为C，其他T保持不变，从而使reads可以直接比对到参考基因组。 （三）甲基化水平计算 甲基化水平可根据未转化为 T 的 C 与转化为 T 的 C 的 reads 的比例计算得到，即： Beta-value = C-reads / (C-reads + T-reads) * 100% 其中，Beta-value 即为该胞嘧啶的甲基化水平，C-reads 为覆盖该位点的支持甲基化的reads 数目（测得该位点为 C 的 reads），T-reads 为覆盖该位点的不支持甲基化的 reads 数目（测得该位点为 T 的 reads）。 计算原理示意图如下：利用BSMAP统计甲基化水平。 （四）差异甲基化区域（DMR）鉴定及统计 DMR检测使用权威期刊发表的metilene软件。该软件先将基因组进行预分段，以排除较长序列中不包含CG位点的片段。随后，利用二元分隔算法，递归缩小检测范围，以搜索得到组间累积平均甲基化差异最大的区域，作为可能的DMR；最后，结合双重统计学检验（MWU-test和2D KS-test），得到准确的DMR。检测原理如下图所示：本分析检测DMR的标准如下： （1）区域平均甲基化差异不小于0.1； （2）CpG位点数不少于5个； （3）区域长度不小于50 bp； （4）甲基化水平差异统计检验的校正P值小于0.05； （5）2D KS-test检验P值小于0.05。 （五）信息分析流程示意图 DNA甲基化组学研究的核心内容在于对DNA甲基化数据的挖掘。DNA甲基化一般遵循三个步骤进行数据挖掘。 首先，进行整体全基因组甲基化变化的分析，包括平均甲基化水平变化、甲基化水平分布变化、降维分析、聚类分析、相关性分析等。 其次，进行甲基化差异水平分析，筛选具体差异基因，包括DMC/DMR/DMG鉴定、DMC/DMR在基因组元件上的分布、DMC/DMR的TF结合分析、时序甲基化数据的分析策略、DMG的功能分析等。 最后，将甲基化组学&转录组学关联分析，包括Meta genes整体关联、DMG-DEG对应关联、网络关联等。 Whole-Genome Bisulfite Sequencing of Two Distinct Interconvertible DNA Methylomes of Mouse Embryonic Stem Cells. 两种状态的小鼠胚胎干细胞的甲基化组学研究 1、背景 小鼠胚胎干细胞一般生长在含有血清的基质中，被称作血清干细胞(serum ESCs)；加两种激酶抑制因子使胚胎干细胞在无血清的情况下更能保持多能性的基态，这种干细胞称为2i干细胞(2i ESCs)；这两种状态的胚胎干细胞可以互相转化。以前这方面的甲基化研究大多基于质谱，覆盖度和研究结果有限，尚缺乏2i胚胎干细胞的甲基化组学研究。 2、方法 利用全基因组重亚硫酸盐甲基化测序（WGBS），对这两种可互相转换的小鼠胚胎干细胞进行甲基化组学研究 3、结论 全面准确的检测了两种小鼠胚胎干细胞的DNA甲基化修饰并进行了系统的比较；同serum ESCs相比，雄性2iESCs全局低甲基化；在血清中，雌性ESCs跟雄性2i ESCs类似呈现全局低甲基化，而在2i ESCs状态下，甲基化水平会进一步降低。以上就是关于全基因组甲基化测序实验流程和分析思路的介绍。 参考文献： Ashburner, M. and C. A. Ball, et al. Gene ontology: tool for the unification of biology. The Gene Ontology Consortium. Nat Genet, 2000, 25 (1): 25-9. Dirk Schübeler. Function and information content of DNA methylation. Nature, 2015, 517: 321–326. Frank Jühling et al. metilene: Fast and sensitive calling of differentially methylated regions from bisulfite sequencing data. Genome Research, 2016, 26: 256-262. Kanehisa M, Goto S. KEGG: kyoto encyclopedia of genes and genomes. Nucleic acids research, 2000,28(1): 27-30. Tadafumi Kato Kazuya Iwamoto. Comprehensive DNA methylation and hydroxymethylation analysis in the human brain and its implication in mental disorders. Neuropharmacology, 2014, 80: 133-139. Xiaojing Yang et al. Gene Body Methylation Can Alter Gene Expression and Is a Therapeutic Target in Cancer. Cancer Cell 26, 577–590. Yuanxin Xi et al. BSMAP: whole genome bisulfite sequence MAPping program. BMC Bioinformatics, 2009, 10:232. Gao F, et al. De novo DNA methylation during monkey pre-implantation embryogenesis. Cell Res. 2017 Apr;27(4):526-539. pii: cr201725.
