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Taq DNA聚合酶的应用与改造历程
1986年，Mullis先生正式公布了PCR技术的论文（Mullis, 1986），从此开启了现代分子生物学的大门。当时，由于使用的是大肠杆菌聚合酶I（Klenow），每个循环都需要补充新的聚合酶，操作十分麻烦。1988年，Saiki等（Saiki, 1988）将一种从 Thermus aquaticm 分离出的耐热型DNA 聚合酶用于PCR技术，成功完成了DNA的自动扩增，这个聚合酶就是“大名鼎鼎”的Taq DNA聚合酶。Taq DNA聚合酶的发现，使PCR变成一种便利的、普遍的实用分子生物学技术。
30多年来，越来越多的其它的优秀的耐热型DNA聚合酶用于PCR技术，比如Pfu系列、Vent系列、KOD系列，但Taq DNA聚合酶始终是PCR聚合酶的主力军。到目前，Taq仍然是市场份额最大，种类最繁多，应用最广泛的热稳型DNA聚合酶。Taq聚合酶缺乏3’-5’校正活性，但具有5’-3’外切活性和末端加A的特点，在sanger测序、qPCR、TA克隆等领域具有独特的应用。同时，研究人员对Taq DNA聚合酶的改造也从未停止，这正是Taq DNA聚合酶在PCR应用中生生不息的根本动力。下面，我就来介绍一下Taq DNA聚合酶的应用及改造历程。
Taq DNA聚合酶是从一种叫做水生栖热菌（ Thermus aquaticus ）的嗜热细菌中分离出来的（Chien, 1976），这种细菌是从美国黄石国家森林公园的火山温泉中分离得到的，生长在70-75℃极富矿物质的高温环境中（Brock, 1969）。因此，Taq DNA聚合酶具有极高的热稳定性，或许能够承受PCR的热变性步骤。1988年，Saiki等将Taq DNA聚合酶用于体外PCR扩增，不但实现了PCR自动化，还因为提高了退火和延伸温度而提高了产物特异性。这个研究鼓励了更多的技术人员使用Taq DNA聚合酶进行PCR，1989年，Lawyer等利用特异性探针从Taq DNA聚合酶基因文库中钓取了Taq DNA聚合酶全长基因，最终得到一个2499bp的编码序列，GC%高达68%，他们将该基因克隆到大肠杆菌中，通过诱导表达和分离纯化得到纯的Taq DNA聚合酶。
Taq DNA聚合酶全长832aa，相对分子量94KD，预测的等电点约为6.0，理论总平均亲水指数为-0.282。现将其酶学特点罗列如下：
① 良好的耐热型，最适催化温度在75-80℃，95℃半小时后仍保留50%以上的活性。Taq DNA聚合酶是Mg 2+ 依赖型聚合酶，最适浓度范围是2-4mM。Taq DNA聚合酶还需要单价阳离子，在10-55 mM KCl中具有最大活性。有研究认为Na + 会抑制聚合酶活性，但有些研究中聚合酶在Na + 环境中也能够正常扩增。
② 5’-3’聚合活性，该特性对温度具有较高的敏感性，70℃时，Taq DNA聚合酶能够以60nt/s的速率聚合DNA链，55℃时降为24nt/s，37℃时为1.5nt/s，22℃时基本停止扩增（Innis, 1988）。
③ 5’-3’外切核酸酶活性，Taq DNA聚合酶是少数具有这一活性的DNA聚合酶之一。1991年，Holland等（Holland, 1991）利用Taq DNA聚合酶的5’-3’外切活性切除5’端放射性标记的DNA探针，通过放射性信号的变化，实现PCR产物的特异性检测。这一研究，为qPCR技术的发展奠定了基础，从此，Taq DNA聚合酶也成了探针法qPCR技术的指定聚合酶。
④ 部分PCR产物3’末端加A，1988年，Clark等发现Taq DNA聚合酶会在新生链的3’末端添加无模板核苷酸，这一特征使Taq DNA聚合酶的PCR产物能够直接用于TA克隆。但是实际应用时，情况要复杂得多， 1993年，Hu等报道了8种聚合酶3’末端延伸的情况，发现Taq DNA聚合酶在PCR产物的3’末端添加A或其它碱基。1996年，Magnuson等系统性研究了Taq DNA聚合酶3’末端加A的概率，发现3’末端加A并不高，与反向引物5’端碱基种类密切相关，他们还指出这种不完全的碱基添加不利于在等位基因分形和TA克隆。
⑤ 无3’-5’校正活性，虽然Taq DNA聚合酶与大肠杆菌聚合酶I有很高的结构相似性（包括3’-5’外切核酸酶结构域），但它缺乏3’-5’外切核酸酶活性，这降低了其在PCR扩增中的忠实性。关于Taq DNA聚合酶的错误率，不同的报道差异很大，Tindall等（Tindall, 1988）测定的突变率为1/9000，Cline等（Cline, 1996）测定的突变率为8.0±3.9×10 -6 。这种差异的原因有两个：一、测试方法不同，比如lacZα和lacI，二、酶纯度和实验条件有差异。抛开这些错误率数据，实事求是的讲，我使用Taq DNA聚合酶多年，用于一般性扩增保真性还可以，一般1-2.5kb的目标片段，挑取两个克隆基本能得到正确的克隆。用于困难模板扩增时，错误率较高，挑取4-6个克隆子基本也能得到正确克隆。
( 上述所列的酶的催化性能参数，在不同的研究中是有较大变化，因为可能使用的酶纯度不同，或者使用的buffer不同，模板、引物、仪器、反应体系甚至PCR管壁的薄厚都会导致PCR表现的差异。这些数据只是一个参考，实际使用中应以试验结果为准。 )
Taq DNA聚合酶属于聚合酶家族A，是一个单体酶，它与大肠杆菌聚合酶I（pol I）具有很高的结构同源性。1995年，Kim等公布了Taq DNA聚合酶的晶体结构，为解释其耐热性、催化活性及分子改造奠定了基础，下面将其结构特点罗列如下：
① Taq DNA聚合酶包括三个结构域，1-291：5’-3’外切核酸酶结构域，292-423：该结构域对应于pol I的3’-5’外切酶结构域，两者虽然具有结构相似性但无序列同源性，因此Taq DNA聚合酶不具有3’-5’外切活性，424-832：5’-3’聚合活性结构域。
② 5’-3’外切结构域是一个功能完整的独立结构域，该结构域的缺失不会使Taq丧失聚合活性，但对酶的催化性能有一些影响。Barnes（Barnes, 1992）构建了一个N端236aa缺失的Taq突变体，发现仍具有完整的聚合活性，且保真性有所提高。Lawyer等（Lawyer, 1993）发现N端289aa缺失的大片段耐热性比全长酶更高，且盐离子耐受能力也提高了，但持续合成活性降低十倍。Merkens等（Merkens, 1995）认为Klentaq持续合成能力的下降与5’-3’外切结构域结合DNA有关，结合作用阻止了酶与DNA底物的彻底解离，后来很多研究人员也支持这一观点。此外，5’-3’结构域还对Taq DNA聚合酶的底物特异性有很大影响，5’-3’结构域删除片段对引物3’端错配敏感性显著下降，对ddNTP的掺入能力增强。从三维结构上看外切结构域与聚合结构域距离很远（大于70Å），很难理解它是如何与聚合结构域协作的，Kim等也无法解释这个现象，他们推测5’-3’外切结构域在溶液中的位置与晶体中不同，要更接近聚合结构域。
③ Taq DNA聚合酶3’-5’外切酶结构域比pol I短，缺少4个长度8-27aa的loop结构，并且pol I中担负金属离子结合的关键残基D424、D501、D355、E357在Taq中被替换为L356、R405、G308、V310，酸性残基上的羧基能够与金属离子形成离子键，被替换后无法再与金属离子结合，Kim等推测这是Taq DNA聚合酶失去3’-5’外切酶活性的主要原因。
PCR技术改变了现代分子生物学，而Taq DNA聚合酶改变了PCR。随着技术不断的发展，PCR又细分为功能各异的种类，分别应用于不同的领域。在有些领域，比如高保真扩增，Taq DNA聚合酶被具有校正活性的酶取代，有些领域，如直接PCR、等位基因检测等领域，Taq DNA聚合酶还具有重要的应用，还有些领域，如Sanger测序、探针法qPCR、TA克隆，Taq DNA聚合酶仍不可替代，下面我就列举几个介绍一下。
Taq DNA聚合酶发现了几十年，不但没有被取代，反而在分子生物学领域具有越来越广泛的应用。这一方面依赖于它自身的功能和特点，另一方面也依赖于研究人员对其不断的进化与改造。通过定点突变、结构域重组、定向进化等技术，Taq DNA聚合酶获得了许多催化性能改善或展现新功能的突变体，拓宽了酶的应用范围，下面就来做一个回顾。
. Journal of bacteriology, 1969, 98(1): 289-297. 从黄石国家公园的各种温泉和加利福尼亚的温泉中分离出一种水生栖热菌，命名为Thermus aquaticus YT-1，该细菌是专性需氧菌，其最适pH为7.5至7.8。生长的最佳温度为70°C，最高为79°C，最低为40°C。 . Journal of bacteriology, 1976, 127(3): 1550-1557. 介绍了一种从Thermus aquaticus分离出的DNA聚合酶，这种酶的最适温度为80℃，需要dNTP和镁离子，最适pH为8.0，分子量63KD-68KD。 Sanger, F., Nicklen, S., and Coulson, A. R. (1977). DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74, 5463–5467. 介绍了Sanger测序的原理、方法和应用。 //Cold Spring Harbor symposia on quantitative biology. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1986, 51: 263-273. 介绍了在体外利用大肠杆菌pol I Klenow片段进行DNA扩增的方法。 . Proceedings of the National Academy of Sciences, 1987, 84(14): 4767-4771. 介绍了利用T7噬菌体DNA聚合酶突变体进行DNA测序的效果，突变体的3’-5’外切活性的仅剩野生酶的0.01%，测序读长和均匀性显著改善。 . Biochemistry, 1988, 27(16): 6008-6013. 介绍了基于lacZa的蓝/白色斑测定DNA聚合酶保真性的方法，测定了AMV Pol、Pol I(KF)和Taq的保真性。 . Science, 1988, 239(4839): 487-491. 介绍了利用从Thermus aquaticus中分离的一种耐热型DNA聚合酶，进行体外DNA扩增的方法及效果。 . Proceedings of the National Academy of Sciences, 1988, 85(24): 9436-9440. 介绍了Taq DNA聚合酶在PCR产物测序中的表现。 . Nucleic acids research, 1988, 16(20): 9677-9686. 介绍了一些真核和原核来源（包括Taq DNA聚合酶）的DNA聚合酶，在无模板指导情况下，将脱氧核糖核苷酸添加到平端DNA底物的3’羟基末端的特征。 . Journal of Biological Chemistry, 1989, 264(11): 6427-6437. 介绍了Taq DNA聚合酶的克隆、大肠杆菌表达及酶学特征研究。 . Nucleic Acids Research, 1991, 19(13): 3749. 介绍了一种提高PCR产量和特异性的方法：将模板与PCR试剂预先加热到高于退火温度的温度，在热块上混合后再进行PCR。 . Proceedings of the National Academy of Sciences, 1991, 88(16): 7276-7280. 介绍了利用Taq DNA聚合酶5’-3’外切活性切除放射性标记探针5’端碱基，通过放射性信号变化检测DNA的方法，促进了探针法qPCR技术的发展。 . Gene, 1992, 112(1): 29-35. 介绍了一个N端236aa缺失的Taq DNA聚合酶突变体KlenTaq，其保真性高于全长酶。 . Nucleic acids research, 1992, 20(17): 4567-4573. 介绍了基于Taq DNA聚合酶检测SNP的原理：如果引物3’末端与模板不匹配，Taq DNA聚合酶扩增效率很低甚至无法扩增靶标基因。 . Genome research, 1993, 2(4): 275-287. 介绍了Taq全长和N端删除片段∆289-Taq（Stoffel片段）的克隆表达及酶学性质研究，结果∆289-Taq的热稳定性、盐离子耐受性高于全长酶，但持续合成降低10倍。 . DNA and cell biology, 1993, 12(8): 763-770. 介绍8种来源于噬菌体、大肠杆菌、栖热菌、火球菌等生物的DNA聚合酶，无模板3’延伸的特点，指出末端延伸的碱基具有一定偏好性，与末端碱基种类有关。 . Bio/Technology, 1994, 12(5): 506-509. 介绍了几种高亲和力的抗Taq DNA聚合酶单克隆抗体，37℃时能完全抑制Taq的活性，高温变性后又能够完全释放出Taq的活性。 . Journal of immunological methods, 1994, 172(2): 147-163. 介绍了九种不同的针对Taq DNA聚合酶重组体的单克隆抗体与Taq的免疫学作用。 . Proceedings of the National Academy of Sciences, 1994, 91(6): 2216-2220. 介绍了通过混合Klentaq1与低浓度的Pfu能够显著提高PCR延伸长度的现象。 Barnes W M. Thermostable DNA polymerase with enhan
NucleicAcidsResearch发表文章要原始数据吗
不需要的。事实上，任何高质量的论文都要做大量的实验和海量的数据，分析结果也是在此基础上优化出来的，才是最科学的。
